Tytuł projektu:

Badanie kinetyki inaktywacji enzymów roślinnych z grupy oksydoreduktaz przy użyciu ditlenku węgla w stanie nadkrytycznym i wysokich ciśnień hydrostatycznych

Projekt realizowany jest przez Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. W. Dąbrowskiego w ramach programu SONATA 9 finansowanego przez NCN pod kierownictwem dr hab. inż. Krystiana Marszałka, prof. IBPRS.

Okres realizacji projektu: 12.02.2016 – 11.09.2018

Całkowity koszt projektu: 257 800,00 zł

numer projektu: 2015/17/D/NZ9/02079

numer umowy: UMO-2015/17/D/NZ9/02079

1. Cel prowadzonych badań / hipoteza badawcza

Celem projektu badawczego jest udowodnienie hipotezy, że istnieje możliwość inaktywacji polifenolooksydaz i peroksydaz przy użyciu innowacyjnej technologii utrwalania żywności: ditlenku węgla pod wysokim ciśnieniem (HPCD), w tym również w stanie nadkrytycznym (SCCD). W celu sprawdzenia hipotezy przeprowadzone zostaną badania podstawowe roztworów modelowych: polifenolooksydaz(PPO) i peroksydaz (POD), w pH optymalnym dla każdego z nich oraz modeli enzym/-y – substrat/-y w pH charakterystycznym dla produktów owocowych. Zdobyta wiedza zostanie zweryfikowana na uniwersalnej matrycy owocowej (sterylny sok pozbawiony natywnych enzymów z mieszaniną handlowych enzymów) oraz na świeżym naturalnie mętnym soku jabłkowym bogatym w natywne enzymy.

Metodą odniesienia będzie obróbka za pomocą wysokich ciśnień (HPP). Planuje się, że cel pracy zostanieosiągnięty przy ciśnieniach 10 – 60 – krotnie niższych w stosunku do metody HPP.

Zastosowana metoda badawcza / metodyka

Proces HPCD/SCCD będzie prowadzony z wykorzystaniem nowoczesnej aparatury Spe-ed SFE
(Applied Separations, USA), o parametrach pracy p do 69 MPa i T do 160ºC, będącej na wyposażeniu IBPRS, natomiast proces HPP przy współpracy z Instytutem Wysokich Ciśnień UNIPRESS PAN na aparaturze U-4000 (UNIPRESS, Polska) o parametrach pracy p do 600 MPa i T do 50ºC. Zarówno inaktywacja drobnoustrojów jak i enzymów najczęściej przebiega zgodnie z kinetyką reakcji pierwszego rzędu: A= A0 exp(-kt) , gdzie A jest aktywnością enzymu, A0 jest początkową aktywnością enzymu i k jest stałą szybkości reakcji. W przetwórstwie żywności kinetyka reakcji pierwszego rzędu często opisywana jest parametrem D. Wartość D jest to czas potrzebny do 90% redukcji aktywności enzymu pod stałą temperaturą lub ciśnieniem i jest niezależna od początkowej aktywności enzymu, natomiast zależy od rodzaju enzymu, temperatury, rodzaju środowiska i metody grzewczej. Wartość ta może być wyrażona jako: log A/A0 = – t/D.
Drugi istotny parametr w badaniu kinetyki reakcji to parametr z, czyli wzrost temperatury potrzebny do 90% redukcji D. Wartość z można obliczyć na podstawie wartości D w funkcji temperatury: logDT = logDTref -(T-Tref)/z lub ciśnienia logDP = logDPref-(P-Pref)/z, gdzie D jest ustalane na podstawie temperatury Tref bądź ciśnienia Pref odniesienia. Stała szybkości reakcji (k) może być obliczona na podstawie wzoru Arrheniusa i Eyringa, odpowiednio w funkcji temperatury i ciśnienia. W dostępnej literaturze brak jest doniesień charakteryzujących wartości D, z i k dla badanych enzymów w funkcji temperatury i ciśnienia dla metody HPCD/SCCD. Badania własne wskazują, że, oprócz temperatury, ciśnienie również odgrywa istotną rolę w inaktywacji enzymów, dlatego w projekcie zaplanowano badanie tych wartości dla obu zmiennych. Proponowane są następujące metody analityczne z zastosowaniem aparatury będącej na wyposażeniu laboratorium IBPRS:

• pH, kwasowość, ekstrakt zgodnie z PN,
• Zmiany w strukturze enzymów z użyciem w oparciu o krystalografię (współpraca międzynarodowa),
• aktywności enzymów PPO i POD metodą spektrofotometryczną (Thermo Genesys 10 UV, USA),
• zawartości wybranych polifenoli metodą DAD – HPLC (Waters 2995, Waters 2996),
• całkowita zawartość polifenoli z odczynnikiem Folin-Ciocoltaeu (Thermo Genesys 10 UV, USA),
• zawartość witaminy C (AA + DHAA) metodą DAD-HPLC (Waters 2995, Waters 2996),
• zawartość glukozy, fruktozy i sacharozy metodą IR-HPLC (Waters 2695, Waters 2414),
• parametry barwy w systemie L*, a*, b* metodą kolorymetryczną (Konica Minolta, USA).
Eksperyment zostanie zaplanowany zgodnie z RSM i planem Plackett-Burmanna a rezultaty opracowane programem Statistica 10® z zastosowaniem: analizy wariancji, regresji Pearsona i analizy skupień.

Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji i społeczeństwa

Nowoczesne metody utrwalania produktów owocowych i warzywnych oparte są często na stosowaniu małych dawek ciepła w celu zachowania wartości sensorycznej i żywieniowej surowców. Niższa dawka ciepła, mimo zapewnienia bezpieczeństwa mikrobiologicznego, jest często nieskuteczna w aspekcie inaktywacji enzymów, przyczyniając się m.in. do degradacji związków fenolowych podczas przechowywania. W związku z tym kontrola procesów inaktywacji enzymów w przetwórstwie żywności jest niezbędna. W niniejszym projekcie skupiono się głównie na zdobyciu wiedzy dotyczącej mechanizmów inaktywacji enzymów i parametrach kinetyki tych procesów pod wpływem metody HPCD/ SCCD. Drugim, innowacyjnym aspektem projektu będzie ustalenie kluczowych parametrów kinetyki inaktywacji enzymów w funkcji temperatury i ciśnienia dla obu technik utrwalania oraz przy współpracy międzynarodowej zastosowanie metod krystalograficznych do badania zmian struktury enzymów podczas procesu utrwalania. Problem inaktywacji enzymów tkankowych nietermicznymi metodami utrwalania żywności nie został dotąd rozwiązany. Pozytywna weryfikacja hipotezy może przyczynić się do rozwoju innych dziedzin wykorzystujących enzymy m.in. w oczyszczalniach ścieków, biosyntezie związków i produkcji papieru. Projekt przyczyni się również do stworzenia pełnoetatowego miejsca pracy dzięki czemu wzrośnie potencjał naukowy zespołu oraz zatrudnionego/ej doktoranta/-ki.

Opis efektów:

Streszczenie osiągniętych wyników (cel badań naukowych lub prac rozwojowych, opis najważniejszych osiągnięć, w tym o wykorzystaniu praktycznym uzyskanych wyników).

Celem przeprowadzonych prac było badanie wpływu ditlenku węgla w stanie nadkrytycznym (SCCD) na kinetyki inaktywacji natywnych polifenolooksydaz (PPO) i peroksydaz (POD) obecnych w naturalnie mętnym soku jabłkowym oraz komercyjnie dostępnych preparatów. Świeżo przygotowany sok jabłkowy oraz pasteryzowany sok jabłkowy wzbogacony komercyjnymi preparatami PPO i POD został poddany działaniu SCCD przy zastosowaniu różnych temperatur, ciśnień i czasów prowadzenia procesu. Wyznaczona stała kinetyki inaktywacji wykorzystana została do obliczenia pozostałych parametrów inaktywacji badanych enzymów: czas dziesięciokrotnej redukcji (D-value), temperatura i ciśnienie potrzebne do 90% redukcji D-value (z_t and z_p –values), energii aktywacji (E_a) and objętości aktywacji (V_a) w oparciu o równania Eyring.

Uzyskane rezultaty wskazują, że kinetyki inaktywacji PPO i POD istotnie zależą od parametrów prowadzonego procesu jak również od źródła pochodzenia enzymów. Wzrost temperatury i ciśnienia skutkował wzrostem stałej kinetyki (k-value) i obniżeniem D-value dla obu typów enzymu. POD okazały się być bardziej termo i baro odporne w porównaniu do PPO. Najniższe wartości D-value, z_T i z_P– values odnotowano dla 65°C i 60 MPa dla natywnych PPO. E_a obniżała się wraz ze wzrostem ciśnienia podczas gdy V_a rosła wraz ze wzrostem temperatury.

Dodatkowo zakres pracy poszerzono o badanie kinetyki inaktywacji peroksydaz (POD), polifenolooksydaz (PPO), poligalakturonaz (PG) i pektyno-esteraz (PE) w sokach warzywnych pod wpływem ditlenku węgla w stanie nadkrytycznym. Materiałem badawczym były mętne soki warzywne z buraków, marchwi oraz selera naciowego, bezpośrednio po przygotowaniu utrwalane technika SCCD przy ciśnieniu do 60 MPa, temperaturze do 65°C i czasie do 30 min oraz dla porównania termicznie (25-90°C, 10 min). Najwyższą aktywność we wszystkich badanych sokach wykazywały POD. Niektóre parametry procesu SCCD przyczyniły się do obniżenia aktywności badanych enzymów zgodnie z kinetyką reakcji pierwszego rzędu. Obliczone parametry k-value i D-value charakteryzowały się istotnie niższą wartością w porównaniu do wartości otrzymanej dla soku jabłkowego. Na stabilność POD, PPO, PE i PG wpływała temperatura procesu oraz rodzaj surowca warzywnego. Inaktywacja enzymów techniką SCCD była mniej efektywna w porównaniu do termicznej inaktywacji. Wyniki tych i wcześniejszych badań wskazują, że inaktywacja natywnych enzymów soków warzywnych (pH>5,95), przy użyciu techniki SCCD jest trudniejsza w porównaniu do owocowych (pH <3,5).

Publikacje naukowe:

– Marszałek K., Krzyżanowska J., Woźniak Ł., Skąpska S. [2016] Kinetic modelling of tissue enzymes inactivation and degradation of pigments and polyphenols in cloudy carrot and celery juices under supercritical carbon dioxide, Journal of Supercritical Fluid 117 (2016) str. 26-32

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896844616302224

– Marszałek K., Kruszewski B., Woźniak Ł., Skąpska S. [2017] The application of supercritical carbon dioxide for the stabilization of native and commercial polyphenol oxidases and peroxidases in cloudy apple juice (cv. Golden Delicious),  Innovative Food Science and Emerging Technologies, 39, 42-48

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1466856416306701

– Marszałek, K., Woźniak, Ł., Kruszewski, B., Skąpska, S. [2017] Effect of high pressure techniques on the stability of anthocyanins in fruits and vegetables, International Journal of Molecular Sciences, 18, 277

https://www.mdpi.com/1422-0067/18/2/277

– Marszałek K., Krzyżanowska J., Woźniak Ł., Skąpska S., [2017] Kinetic modelling of polyphenol oxidase, peroxidise, pectin sterase, polygalacturonase and main pigments degradation in beetroot juice during high pressure carbon dioxide treatment, LWT- Food Science and Technology, 85B, 412-417

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643816306892

– Marszałek K., Szczepańska J., Woźniak Ł., Skąpska S, Barba F.J., Brnčić M. Brnčić S.R., 2018, Chapter: The Preservation of Fruit and Vegetable Products Under High Pressure Processing, Encyclopedia of Food Security and Sustainability, Elsevier, doi: 10.1016/B978-0-12-812687-5.22258-2

https://www.elsevier.com/books/encyclopedia-of-food-security-and-sustainability/ferranti/978-0-12-812687-5

– Marszałek K., Woźniak Ł., Barba F.J., Skąpska S., Lorenzo J.M, Zambon A., Spilimbergo S., 2018, Enzymatic, physicochemical, nutritional and phytochemical profile changes of apple (Golden Delicious L.) juice under supercritical carbon dioxide and long term cold storage, Food Chemistry, doi: 10.1016/j.foodchem.2018.06.109

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814618310823

Działania popularyzatorskie:

– Udział w międzynarodowej konferencji 2nd Euro-Mediterranean Symposium on Fruit and Vegetable Processing, Avignon (Francja), 4-6 kwiecień 2016 r., na której zaprezentowano plakat: Kinetic modelling of peroxidise, polyphenoloxidase, polygalacturonase and pectinesterase inactivation and main pigments degradation in beetroot, carrot and celery juice during high pressure carbon dioxide treatments, Autorzy: Marszałek K., Krzyżanowska J., Woźniak Ł., Skąpska S.

– Udział w krajowej IX Ogólnopolskiej Konferencji Naukowej Technologów Przetwórstwa Owoców i Warzyw „Owoce, Warzywa, Grzyby – Żywność i Technologia”, 19-20 maj 2016, Lublin, na której przedstawiono wyniki badań w formie doniesienia: Zastosowanie nadkrytycznego ditlenku węgla do inaktywacji wybranych roślinnych enzymów tkankowych w sokach warzywnych, Autorzy: Marszałek K., Krzyżanowska J., Woźniak Ł., Skąpska S.

– Udział w międzynarodowej konferencji 16^th European meeting of supercritical fluids EMSF 2017, 25-28.04.2017, Lizbona, na której zaprezentowano wyniki badań w formie plakatu: Kinetic model ling on native Apple polyphenoloxidase and peroxidases inactivation under supercritical carbon dioxide, Autorzy: Marszałek K., Kruszewski B., Woźniak Ł., Skąpska S.

– Udział w krajowej konferencji X Ogólnopolska Naukowa Konferencja Technologów Przetwórstwa Owoców i Warzyw, Owoce, warzywa, grzyby innowacje w surowcach i przetwórstwie, 25-26.05.2017, Nieborów, na której zaprezentowano wyniki badań w formie doniesienia: Możliwości inaktywacji natywnych i komercyjnie dostępnych enzymów oksydoredukcyjnych w matrycy soku jabłkowego pod wpływem wysokich ciśnień, Autorzy: Marszałek K., Kruszewski B., Starzonek Sz., Łukasz W., Skąpska S, Rzoska S.

– Udział w międzynarodowej konferencji 12th Edition of the International Symposium on Supercritical Fluids, 22-25.04.2018, Antibes, Francja, na której zaprezentowano wyniki badań w formie plakatu: Stability of mushroom polyphenol oxidases and horseradish peroxidases under supercritical carbon dioxide, Autorzy: Marszałek K., Kruszewski B., Woźniak Ł., Skąpska S.

– Udział w międzynarodowej konferencji 56th EHPRG on High Pressure Science and Technology, Aveiro, Portugalia, 1 – 6.09.2018, na której zaprezentowano wyniki badań w formie plakatu: Influence of high pressure processing on apple juice polyphenols profile during long term cold storage, Autorzy: Marszałek K., Kruszewski B., Starzonek S., Szczepańska J. Woźniak Ł., Skąpska S., Rzoska S. Nagroda za prezentacje posterową.