Selekcja i charakterystyka aktywności metabolicznej szczepów bakterii fermentacji mlekowej o specyficznych właściwościach proteolitycznych względem alergennych białek mąki

Krótki opis projektu: (Cel projektu, zadania, grupy docelowe, efekty projektu)

Mąka pszenna jest podstawowym składnikiem produktów zbożowych, jednocześnie stanowi główny czynnik wywołujący celiakię i alergię pokarmową, czego bezpośrednią przyczyną są obecne w niej białka – albuminy i globuliny oraz prolaminy. Celem projektu było wyselekcjonowanie szczepów bakterii fermentacji mlekowej (LAB) hydrolizujących alergenne białka mąki pszennej. Materiał do badań stanowiły 153 szczepy LAB wyizolowane zarówno w ramach projektu, jak i wcześniejszych badań prowadzonych w Zakładzie Technologii Fermentacji IBPRS, głównie z naturalnie fermentujących zakwasów piekarskich rzemieślniczych i sporządzanych laboratoryjnie. Bakterie zidentyfikowano gatunkowo na podstawie analizy sekwencji genu kodującego 16S rRNA, a następnie zróżnicowano wewnątrzgatunkowo z wykorzystaniem metody RAPD-PCR. W przypadku szczepów nie dających się typować metodą RAPD-PCR zastosowano analizę MLST (Multilocus Sequence Typing). Pierwszą selekcję proteolitycznych szczepów LAB przeprowadzono na pożywkach zawierających gluten jako jedyne źródło azotu, na pożywce stałej a następnie płynnej, prowadząc hodowle w różnych warunkach fizycznych (temperatura inkubacji 30°C i 37°C oraz PH o wartościach 4,8; 5,8 i 6,8). Do dalszych badań wybrano 11 szczepów LAB należących do gatunków Lactobacillus (L.) plantarum (2 szczepy), L. helveticus, L. rhamnosus, L. sakei, L. curvatus, L. coryniformis, W. cibaria, Pediococcus (P.) pentosaceus (2 szczepy) i P. acidilactici, wyróżniających się największą dynamiką wzrostu w pożywcze selekcyjnej. Badane szczepy LAB charakteryzowano pod wzglądem cech istotnych pod względem aplikacyjnym, tj. biosyntezy kwasu mlekowego i octowego oraz aktywności antybakteryjnej. Z użyciem 11 wyselekcjonowanych szczepów bakterii fermentacji mlekowej utworzono kultury starterowe do inicjowania fermentacji zakwasów pszennych. Szczepy LAB zastosowano w monokulturach i 10 kulturach mieszanych. Do badań włączono także szczep P. acidilactici DGGE, wyizolowany w ramach badań mających na celu ocenę zmian zachodzących w mikroflorze zakwasów pszennych przygotowanych z użyciem badanych szczepów LAB metodą PCR-DGGE (ang. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Przygotowano także 2 próbki kontrolne: zakwaszaną chemicznie do pH=4,0 – 4,4 mieszaniną kwasu octowego i mlekowego o stosunku molowym 4:1 i z dodatkiem antybiotyku oraz próbkę kontrolną będącą mieszaniną mąki i wody nie poddawaną inkubacji. W zakwasach, na początku inkubacji i po 24 godzinach fermentacji, oznaczono liczbę LAB i pleśni oraz właściwości fizykochemiczne: pH i kwasowość ogólną w przeliczeniu na kwas mlekowy. W celu określenia stopnia degradacji gliadyn wykonano analizy immunoenzymatyczne, stosując reakcję z przeciwciałami R5 testem ELISA Ridascreen® Gliadin (R-Biopharm, Fabimex). Przy pomocy analizy wariancji stwierdzono istotne różnice w ilości gliadyn w zakwasach piekarskich (α=0,05). W zakwasach sporządzonych z udziałem szczepów L. helvetius 10, L. plantarum W37/54 i P. pentosaceus 1850(3), ilość gliadyn była istotnie niższa, w porównaniu do próbki kontrolnej zakwaszanej chemicznie, z dodatkiem antybiotyku. W przypadku pozostałych szczepów różnice były nieistotne statystycznie można przyjąć, że zdolność do hydrolizy gliadyn jest zjawiskiem stosunkowo rzadkim. Stanowi to przykład różnorodności LAB wchodzących w skład mikrobioty mąki i ciast zakwasowych, będącej efektem przystosowania szczepów bakterii do warunków środowiska. Aby zaobserwować zmiany w profilach białkowych, przebiegające podczas procesu fermentacji zakwasów, wykonano elektroforezę próbek zakwasów pszennych w warunkach denaturujących (SDS-PAGE). W wyniku rozdziału elektroforetycznego trzech wyekstrahowanych frakcji, albumin i globulin, glicyn oraz glutenin, otrzymano złożone profile białkowe. Zaobserwowano całkowitą lub częściową hydrolizę niektórych białek w odniesieniu do próbek kontrolnych, z których izolowano białka w chwili rozpoczęcia inkubacji oraz zakwaszanych chemicznie i z dodatkiem antybiotyku. Największy stopień hydrolizy (13 polipeptydów) stwierdzono w przypadku frakcji albumin/globulin, natomiast we frakcji glicyn istotne różnice dotyczyły 4 polipeptydów. Nie wykazano różnic istotnych statystycznie w stopniu hydrolizy glutenin pomiędzy próbkami kontrolnymi a próbkami pochodzącymi z zakwasów prowadzonych z badanymi szczepami. Analiza profili białkowych metodą SDS-PAGE wykazała mniejsze zróżnicowanie aktywności proteolitycznej w obrębie badanych szczepów LAB niż przy zastosowaniu metody ELISA. W dalszym etapie badań oceniono immunoreaktywność poszczególnych frakcji białkowych metodą Western-Blot wobec przeciwciał IgE pochodzących z surowic pacjentów ze zdiagnozowaną alergią pokarmową na gluten. Otrzymane profile białkowe w porównaniu z profilami SDS-PAGE charakteryzowała mniejsza liczba polipeptydów, o masie molekularnej od ok. 50 do 20 kDA. Badane szczepy zdolne były do hydrolizy pewnych epitopów obecnych w białkach pszennych, nie wykazano jednak różnic w profilach Westrn-Blot pomiędzy próbkami zakwasów przygotowanych z udziałem różnych szczepów LAB (monokultur i kultur mieszanych). W profilach albumin/globulin zakwasów przygotowanych z użyciem wszystkich szczepów obserwowano brak lub częściową hydrolizę wiążących przeciwciała IGE polipeptydów o masie odpowiednio ok. 24 kDa i 19 kDa, a w profilach gliadyn o masie ok. 48 kDa. Brak tych zmian w obu próbkach kontrolnych wskazuje, że były one wywołane aktywnością proteolityczną enzymów bakteryjnych szczepów LAB. W przypadku frakcji gliadyn, jedynie w zakwasie kontrolnym K0h wykazano obecność wiążących przeciwciała polipeptydów o masie molekularnej ok. 20 i 21,5 kDa. Zarówno we frakcji albumin/globulin, jak i gliadyn pochodzących z zakwasów pozostały jednak immunogenne epitopy. W kolejnym etapie realizowanego projektu oceniono podatność polipeptydów wyizolowanych fermentujących zakwasów piekarskich badanych i kontrolnych na trawienie in vitro dwoma enzymami trawiennymi, pepsyną i trypsyną. Badano 6 stężeń enzymów proteolitycznych. Profile elektroforetyczne zakwasów poddanych działaniu enzymów trawiennych, przygotowanych z udziałem badanych szczepów LAB, były identyczne i wskazywały na hydrolizę alergennych polipeptydów we frakcji albumin i globulin przy stężeniu 2,5 mg pepsyny i 0,5 mg trypsyny oraz 5 mg pepsyny i 1 mg trypsyny/1g zakwasu oraz we frakcji gliadyn przy stężeniu 0,05 mg pepsyny i 0,05 mg trypsyny/1g zakwasu. Ze względu na proteolizę polipeptydów w próbkach kontrolnych, na podstawie uzyskanych wyników trudno jednoznacznie stwierdzić, że badane szczepy bakterii prowadzą do modyfikacji białek zawierających wiążące IgE epitopy, która umożliwia późniejszą proteolizę przez enzymy trawienne. Uzyskane wyniki wskazują więc że proteolityczna aktywność wyselekcjonowanych szczepów LAB nie jest na tyle wysoka, aby można było wykorzystać je do całkowitego rozkładu białek alergennych i wypieku pieczywa z alergennej mąki pszennej/żytniej, przeznaczonego dla osób z alergią pokarmową na gluten lub celiakią (w zakwasach piekarskich przygotowanych z mąki pszennej, poddanych fermentacji z udziałem wyselekcjonowanych szczepów, obecne były epitopy wiążące przeciwciała IgE). Zdecydowano zatem się przeprowadzić próby otrzymania pieczywa o obniżonej zawartości alergenności z zastosowaniem zakwasów pszennych otrzymanych z udziałem 3 szczepów LAB, L. Helvetius 10, L. plantarum W37/54 i P. pentosaceus 1850(3) oraz przy zastąpieniu większości przewidzianej recepturą mąki pszennej mąką jaglaną (z prosa) i/lub gryczaną. Ostatecznie wybrano wariant receptury ciasta zawierający 20% mąki pszennej wprowadzonej w zakwasie, 80% mąki jaglanej oraz dodatek gumy guar. Pieczywo oceniono pod względem sensorycznym. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że zastosowanie bakteryjnej kultury starterowej złożonej z biomasy szczepu Pedicoccus pentosaceus 1850(3) do otrzymywania zakwasowego pieczywa o obniżonej alergenności pozwoliło na podwyższenie jakości sensorycznej takiego pieczywa. Zastosowania praktyczne: Wyselekcjonowane w ramach prowadzonych badań szczepy LAB mogą zostać wykorzystane jako unikalne kultury starterowe do otrzymania wyrobów piekarskich specjalnego przeznaczenia (chleb, ciast) sporządzonych na bazie mąki niechlebowej.

Wykaz prac opublikowanych w wyniku realizacji projektu:

Stefańska I., Piasecka-Jóźwiak K., Kotyrba D., Kolenda M., Stecka K. M.: Selection of lactic acid bacteria strains for the hydrolysis of allergenic proteins of wheat flour. Journal of the Science of Food and Agriculture (2016).